分會

第三十二分會：化學生物學

摘要

Sirtuin是一類人源的NAD+依賴的組蛋白去乙?；福灿?個亞型，分別為Sirtuin 1-7。近年來，除了去乙?；拿富钚?，Sirtuin還被報道具有去琥珀?；痆1]、去肉豆蔻酰化[2]、去4-氧代壬?；鵞3]等新的酶活性。Sirtuin通過調節(jié)組蛋白或非組蛋白的各種?；揎?，不僅廣泛參與細胞的轉錄調控、代謝等重要生理功能，而且與衰老及衰老相關的神經退行性疾病、心腦血管疾病、癌癥等疾病密切相關[4,5]，因此也成為了科研人員眼中炙手可熱的藥物靶點。但由于缺乏高抑制活性、選擇性及成藥性抑制劑的發(fā)現(xiàn)，至今仍未有靶向Sirtuin的藥物被批準上市，所以建立準確、簡單、快速的Sirtuin調節(jié)劑篩選方法是必要的。 目前，Sirtuin活性檢測方法主要有質譜法、高效液相色譜法、熒光法等，其中適合高通量篩選的僅有基于香豆素的熒光法和基于FRET的熒光法[6,7]，但它們的檢測過程均需要兩步才能完成：首先經Sirtuin催化反應，然后再經胰酶水解，才能測定熒光強度。這增加了檢測體系的復雜度，且在檢測中易出現(xiàn)假陽性結果，降低了篩選的準確性。 為克服傳統(tǒng)Sirtuin活性檢測方法的缺陷，本文設計了一種一步快速檢測Sirtuin活性的方法，即采用香豆素碳酸丁酯組裝的?；嚢彼嶙鳛樾》肿訜晒馓结?，當Sirtuin去除賴氨酸殘基ε-NH2上的酰化修飾后，游離的氨基定量的與熒光基團上丁基氧羰?；l(fā)生分子內的親核取代反應，點亮熒光基團（羥基香豆素）的熒光。通過熒光強度-酶濃度、熒光強度-底物濃度、熒光強度-時間曲線、催化效率等實驗研究，建立了一步快速檢測Sirtuin活性的方法。通過已報道的Sirtuin抑制劑的進一步研究，驗證了該體系熒光強度2 h內穩(wěn)定，S/N>10、CV<10%、Z’>0.6等各項參數(shù)符合高通量篩選要求，建立了Sirtuin調節(jié)劑的高通量篩選方法。綜上，我們設計開發(fā)了一類新的小分子探針，可用于一步高通量篩選Sirtuin調節(jié)劑，簡化了篩選方法，提高了篩選速度與準確性。

關鍵詞

Sirtuin;熒光探針;酶活性檢測;抑制劑;高通量篩選

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